氧自由基与SOD概述

2.1 SOD的分类

根据结合的金属离子不同，SOD主要分为常见的Fe-SOD，Mn-SOD和CuZn-SOD。这些同功酶可以用聚丙烯酰胺活性凝胶电泳分开，也可以根据不同类型SOD对不同抑制剂的敏感程度不同而加以区分。如氰化物可抑制CuZn-SOD而不抑制Mn-SOD和Fe-SOD。因此，用氰化物可以鉴别CuZn-SOD和Mn-SOD以及Fe-SOD。长时间用过氧化氢处理可使CuZn-SOD和Fe-SOD失活，而Mn-SOD基本不受影响，此法可以鉴别Mn-SOD。鉴别不同SOD的另一个方法是将SOD中金属离子去掉，然后分别加入Cu/Zn、Mn或Fe离子。若加入Cu和Zn离子后，酶的活力恢复，则为CuZn-SOD。若加入另外两种金属离子使酶蛋白恢复活力，就是Mn-SOD或Fe-SOD[SL Markland et al., 1976]。

2.1.1 CuZn-SOD的分子结构及理化性质

CuZn-SOD一般由两个相同亚基构成，每个亚基含一个铜原子和一个锌原子。研究发现，不同来源CuZn-SOD在氨基酸序列上显示出明显的进化保守性和高度的序列同源性。在150多个氨基酸组成中，有19个氨基酸残基是完全不变的，另外19个也几乎不变。在19个不变的氨基酸残基中，大部分氨基酸用以构成酶的活性中心。如在牛血红细胞的CuZn-SOD中，His44、His61和His118与Cu离子相连，His44、His69、His78和Asp81与Zn离子相连，而Arg141是CuZn-SOD酶活性所不可缺少的。此外，Cys55和Cys144形成的二硫键对维持CuZn-SOD二聚体的稳定起重要作用。

比较不同来源CuZn-SOD的氨基酸序列后可以看出，无论是来自细菌、真菌、高等植物细胞浆，还是来自动物的各种组织，CuZn-SOD一级结构的同源性都较高。如与高等动物、箭鱼、果蝇、植物、真菌及光合自养细菌的同源性分别为82%、67%、62%、56%和18%[陈淮杨等，1996]。CuZn-SOD结构上的同源性还表现为：(1)与金属辅基相连和参与肽链内部二硫键形成部位附近的氨基酸残基相同；(2)富含甘氨酸残基，它们的大量存在和均匀分布有利于形成酶分子的高级结构；(3)氨基酸序列中都有一个位于分子结构表面的超可变区，可能与免疫学性质有关；(4)羧基末端有一序列同源性很高的区域，在此区域有一精氨酸(Arg141)对酶活力的维持起关键作用。

图1.1 牛红细胞CuZn-SOD的二级结构示意图

Fig. 1.1 the second structure of the bovine Erythrocyte CuZn-SOD

CuZn-SOD高级结构的信息来源于χ射线衍射晶体结构分析。以牛红细胞CuZn-SOD为例，该酶由两个结构相同的亚基构成，亚基主要由β片层组成，α螺旋很少或几乎没有，如图2所示。两个亚基之间通过非共价键的疏水作用结合，两个Cu原子之间相距3.38mm，同一亚基中Cu、Zn相距0.63mm，每个亚基由8股反平行的β折叠和3个无代表性结构的环组成具有拓扑性的桶(β-barrel)[Tainer JA et al., 1982]。CuZn-SOD的活性部分是一个椭圆形的口袋，其外缘一边由Thr135、Gly136、Ala138和Gly139组成，另一边由Gly59、Pro60、His61、Phe62和Gln63组成，Thr135和Arg141构成口袋两侧，Cu，Zn与６个His和１个Asp形成狭长的袋底。Cu与His44，His46，His61，His118相连，Zn与His61，His69，His78，Asp81相连，Cu、Zn之间通过His61形成咪唑桥结构，Cu部分暴露于溶剂中，桶边缘的Arg141有辅助、引导底物向Cu离子靠近的作用，见图3。Zn则深埋于蛋白质结构内部，起稳定酶结构的作用。

图1.３ 牛红细胞CuZn-SOD中铜、锌离子与His61形成的咪唑桥

Fig. 1.3 The imidazole bridge consisting of Cu, Zn and His61 in the bovine Erythrocyte CuZn-SOD

2.1.2 Mn-SOD、Fe-SOD的结构及理化性质

Mn-SOD在真核生物中多为四聚体，在原核生物中多为二聚体，而大多数Fe-SOD为二聚体，这两种SOD的许多性质都十分相似，如它们每个亚基含0.5~1个Mn或Fe离子，任何来源的Mn-SOD和Fe-SOD的一级结构同源性都很高，且均不同于CuZn-SOD的序列。如人与鼠、大肠杆菌的Mn-SOD同源性分别为94％和43%。另外，Mn-SOD和Fe-SOD形成活性中心、催化中心及与金属连接的氨基酸都是保守的。

从晶体结构看，Mn-SOD和Fe-SOD在活性中心和金属-配体簇附近的结构十分相似[Ludwig ML et al., 1991; Stoddard BL et al., 1990]。每个亚基包含两个结构域，一个结构域由三个α螺旋组成，另一个结构域由三个α螺旋和一个β折叠构成。金属结合位点就在这两个结构域之间。围绕活性中心的是几个保守的芳香族氨基酸，其中有三个Tyr、三个Trp和两个Phe，都在距金属离子1mm的范围内。后来，在一些厌氧微生物中又发现了既可以利用Fe离子作为辅基，又可以利用Mn离子作为金属辅基的SOD，命名为Cambialistic SOD(Cambialistic，意为变化的，可变的) [Martin ME et al., 1986]，它们所产生的SOD依赖于氧的存在。

尽管Fe-SOD和Mn-SOD在一级结构及高级结构上显示出极大的相似性，但它们之间仍然存在明显的区别。比较Mn-SOD和Fe-SOD的氨基酸序列后认为，有5个形成活性中心的特征性氨基酸对Mn-SOD或是Fe-SOD是特异的：在Mn-SOD中，它们是Gly76、Gly77、Phe84、Gln154和Asp155，而在Fe-SOD中，它们分别为Ala76，Gln77，Tyr84，Ala154和Gly155。另外，有17个对Mn-SOD和Fe-SOD来说是非常保守的氨基酸残基，它们或与活性位点有关，或是与其形成次级结构有关，通过它们亦可以从一级结构上对两种SOD加以区分[Parker et al., 1988]]。两种SOD对一些化合物的敏感性不同，如Fe-SOD对H2O2敏感而Mn-SOD对H2O2不敏感。同一种生物来源的Fe-SOD和Mn-SOD的抗原性也不同；Fe-SOD可以结合Mn离子，Mn-SOD也可以结合Fe离子，但仅在结合原有的金属离子时才会显示最大的催化活性。因此，通过对一级结构的比较、分析或借助于一些生化试剂的检测可以比较明确地将两种SOD分开。

2.2 SOD的分布

在生物体内，CuZn-SOD主要存在于真核生物细胞质、叶绿体基质和过氧化物酶体中。Mn-SOD主要存在原核生物和真核生物的线粒体中，它还存在于蓝细菌类囊体膜和高等植物的过氧化物酶体中[杜秀敏等，2003]。Fe-SOD主要存在于原核生物中，如蓝细菌和大多数藻类的胞浆中。但是，从个别Fe-SOD前导序列推测，该酶也存在于某些植物的叶绿体中。除了以上这3种SOD酶外，在Streptomyces sp.中发现一种以Ni作为金属辅基的SOD，在Streptomyces coelicolor中还存在性质类似于Fe-SOD的FeZn-SOD[Kim et al., 1996; 1998]。

2.3 SOD的分子进化

厌氧细菌如梭状芽孢杆菌属、绿菌属和脱硫弧菌被认为是地球上原始的生物，它们只含有Fe-SOD，而不含Mn-SOD。说明Fe-SOD出现于生物进化早期，而Mn-SOD是在此基础上进化而来的。后来在兼性厌氧菌中发现了Cambialistic SOD。对四种Cambialistic SOD[Barra D et al., 1990; Matsumoto T et al., 1991; Takao M et al., 1991]进行比较后发现，它们在一级结构上类似于Mn-SOD，但在金属成分和对抑制剂敏感性等性质上又类似于Fe-SOD。这些酶蛋白在体内既能以Mn离子作为辅基，又能以Fe作为辅基，因此代表Fe-SOD和Mn-SOD之间的过渡类型。

在好氧和兼性厌氧细菌体内，一般含有Fe-SOD或Mn-SOD，或者两者都存在。如大肠杆菌在无氧条件下只含有Fe-SOD，而在有氧条件下还存在Mn-SOD。蓝细菌胞浆中含Fe-SOD，而它的类囊体膜上结合有Mn-SOD。

大多数真核藻类在其叶绿体基质里存在Fe-SOD，类囊体膜上结合着Mn-SOD，且多数不含CuZn-SOD，而轮藻中含有CuZn-SOD，说明轮藻是绿藻向高等植物进化的过渡类型。真菌中一般含Mn-SOD和CuZn-SOD。

植物细胞里CuZn-SOD含量最高，主要定位于胞质以及叶绿体和线粒体内外膜之间；植物细胞中的Fe-SOD主要存在于叶绿体中，Mn-SOD主要存在于线粒体基质内。

大多数原始的无脊椎动物细胞里都存在CuZn-SOD。这暗示在动物进化早期就有这类SOD出现。脊椎动物一般含CuZn-SOD和Mn-SOD：CuZn-SOD主要存在于细胞质中，Mn-SOD一般存在于线粒体基质中。最近在动物的胞外液中发现一种特殊的CuZn-SOD，即Ec-SOD(extracellular superoxide dismutase)，它主要存在于血浆、淋巴、子宫液、组织和某些培养细胞的分泌物中。

一般认为，CuZn-SOD是真核生物酶，而对Cu离子的利用和一个链内的二硫键说明CuZn-SOD是在有氧环境中进化而来的。Ec-SOD是在细菌出现后、真菌和植物出现前从CuZn-SOD分化出来的，暗示在有氧环境中，胞外SOD的存在对于机体适应变化的环境和机体自身行使正常的生理功能具有重要意义。

从以上讨论看，Mn-SOD和Fe-SOD有一个共同的祖先，而CuZn-SOD是在以后单独进化的。当最古老的生命产生时，原始大气中是没有氧的。后来由于光裂解等非生物反应，大气中产生了低浓度氧，这时原始厌氧生物不得不以各种方式去适应大气中氧气的存在。有一些生物因此灭绝了，而另一些生物体内则出现了可以消除氧毒害的SOD。因而，可以认为SOD应该是在大气中出现氧分子时进化来的。在漫长的生物进化过程中，SOD在生物适应环境方面扮演着不可替代的角色。虽然SOD间序列同源性的高低不能代表准确的生物进化关系，但氨基酸序列同源性的高低在一定程度上能反映种属间的亲缘关系。自从Feng在构建进化树时第一次用SOD做参考以后[Feng DF and Doolittle RF, 1987]，已有许多研究者用不同类型的SOD序列来推测各种生物在漫长的进化长河中复杂的关系，研究对象包括古细菌[G Schäfer and S Kardinahl, 2003]、细菌[V Chaturvedi et al.,2001; YH Chang et al., 2003; N Cortez et al., 1998]、原生生物[R Fukuhara, et al., 2002]甚至从低等生物真到高等生物的进化[S Moore, et al., 2002]。由此看出，虽然SOD氨基酸序列同源性的高低还没有被广泛用于系统分类，但已被越来越多的分类学研究工作者参考[Y Kawamura et al., 1999; C Poyart et al., 2000; N Brouwer et al., 2003; S Chaturvedi et al., 2001; RG Alscher et al., 2002]，并有可能在今后的系统进行研究方面提供重要参考。

2.4  SOD基因的结构

编码SOD的基因是核基因，它们有单拷贝基因、等位基因，也有多基因家族等多种存在形式。如Leishmania chagasi中存在Fe-SODA和Fe-SODB。Fe-sodA是单拷贝基因，而Fe-sodB则是多拷贝基因[Paramchuk et al., 1997]。Legionella pneumophila的Fe-sod也是多拷贝基因，并且该基因的拷贝数与该菌的抗百草枯(Paraquat)能力相关[Alesia et al.，1994]。玉米SOD基因是多基因家族，由4条SOD基因组成，这些基因的编码区具有高度同源性，但5′非翻译区和3′非翻译区长度有很大差异。动物和其他植物SOD基因是单拷贝基因，但他们可以通过改变可剪接聚腺苷酸位点而产生多种长度的mRNA，从而形成不同的SOD同功酶。

不同细胞定位的SOD基因结构存在差异。如转运到线粒体和叶绿体等细胞器的SOD与细胞质中的SOD在氨基酸序列上的最大不同在于前者含有信号肽(signal peptide)序列，后者不含信号肽序列。这些信号肽富含碱性氨基酸、羟基氨基酸和疏水性氨基酸，而缺乏酸性氨基酸。如酵母的线粒体Mn-SOD前体含有一段由27个氨基酸组成的信号肽序列，用于将SOD酶转运到线粒体[曾庆平，1995]。

2.5 SOD基因突变体及其在生物学研究中的作用  

2.5.1 细菌SOD突变体的构建

SOD突变技术对不同目标菌来说并无本质区别。通常，首先通过插入失活或插入带某种抗性的基因使目标基因失活，然后证实变异的基因与野生型菌株的同源基因发生交换，从而产生稳定的突变体。

目前，尽管有大量的细菌SOD基因已被克隆和测序，但获得的突变体却少之又少。这有可能是因为对有些微生物，如Mycobacteria等病原菌来说，还缺乏有效的技术手段。另外，SOD突变可能是致死的突变，那么就几乎不可能得到真正意义上的突变体。例如始终无法获得Legionella pulumophila Fe-SOD的突变体，因为细胞质内只有1条Fe-SOD，而它又生活在高氧环境下[AB Sadosky et al., 1994]。近几年来，通过反义RNA来研究真核生物基因的功能取得了巨大进展，此策略有望在一些难以操作的菌株上应用。

2.5.2细胞质SOD突变

从大肠杆菌中筛选到了第一个细胞质SOD突变体并对其进行了大量研究[A Carlioz and D Touati, 1986]。在这些Mn-和Fe-SOD同时突变的菌株中，稳定态氧自由基水平比野生菌高100到1000倍。这些氧自由基可能对细胞造成直接的伤害，而大部分毒害如对DNA和膜系统的毒害主要是由羟自由基造成。羟自由基由Fenton反应产生，而该反应是在还原型金属离子存在情况下由过量的氧自由基诱导，所以SOD对超氧阴离子的消除和羟自由基的形成具有重要的调节作用。

其它细菌的突变体的资料还很少，研究重点集中在SOD缺失后其生理活动或代谢活动变化方面。由于内源氧自由基的产生和对氧自由基敏感的蛋白酶依赖于特定的代谢途径和菌体的生育时期，所以还没有一套通用的技术来分析SOD突变所引起的所有的生理生化方面的变化。

2.5.2.1 氧对胞质SOD突变体的损伤作用

只有在有氧条件下，氧自由基才会产生。如果氧自由基不被及时高效清除，则会对机体产生毒害，这一结论已经得到可靠的试验验证。比如在有氧条件下，比较SOD突变体和野生型菌株在丰富培养基上的生长速率和最终生物量时，发现SOD缺陷型生长状态及生物产量与野生型区别不大，但其突变的概率明显上升；如果在有氧条件下，将突变体和野生型菌株接种到基本培养基上时，发现野生型生长正常而突变型不能生长，这时要在培养基中加入全部氨基酸后菌体才会恢复生长。但是在无氧条件下，野生型和突变型的生长状态又基本一致。说明氧确实对SOD突变体有某种损伤作用。

2.5.2.2 胞质SOD突变对机体的损伤及相关的表型变化

氧自由基攻击蛋白会导致特定氨基酸残基氧化、肽链的断裂、反应产物的交联和改变蛋白质电荷数。蛋白质中不同氨基酸残基对氧自由基的敏感性不同；不同氧自由基成分对蛋白质的反应性也不同。一般来说，含硫和巯基的氨基酸残基是氧自由基攻击的敏感位点，因为氧自由基能够置换出半胱氨酸的氢原子，形成硫自由基，此硫自由基又可以和另外的硫自由基结合形成新的二硫键。另外，氧也可以与甲硫氨酸残基形成硫的衍生物。

另外，氧自由基对蛋白的损伤是不可逆的。例如O¯•2  对一些蛋白铁硫中心的氧化损伤[PR Gardner and I Fridovich, 1991]。还有一些蛋白的许多氨基酸残基在氧化时被不可逆地修饰。例如，酪氨酸很容易交联形成二酪氨酸产物[KJA Davies, 1987]；赖氨酸，脯氨酸，精氨酸和丝氨酸氧化合形成羰基[ER Stadtman, 1986]。在金属离子存在下，蛋白质的氧化降解增强。金属离子一般结合于二价阳离子位点，催化Fenton反应形成•OH，因而导致蛋白质阳离子结合位点处的氨基酸残基降解，形成特异位点氨基酸残基损伤[ER Stadtman, 1986]。

胞质SOD突变造成DNA损伤。大量证据表明，氧自由基增加会导致DNA损伤，这可能是氧自由基通过夺取[4Fe-4S]中心的金属离子，从而诱发Fenton反应，并由此导致羟自由基含量的提高[PR Gardner and I Fridovich, 1992]。胞质SOD突变第一次清楚显示过量氧自由基能引起DNA损伤[SB Farr et al., 1986; K Keyer et al., 1995]。研究发现，SOD突变后随着氧浓度增加突变的概率相应增加[D Touati and SB Farr, 1990]；胞质SOD突变后菌体在有氧情况下不能在基本培养基上生长，亦不能通过同源重组修复DNA损伤[D Touati et al., 1995]；而且，由于Fenton反应，过氧化氢介导的杀伤作用增加[K Keyer et al., 1995]。

胞质SOD突变造成代谢缺陷或生长受阻。在基本培养基上生长的微生物需要通过极其复杂的合成途径来合成一些化合物，这些化合物可以保护一些对氧化物敏感的蛋白酶。当SOD突变后，SOD突变体在基本培养基上生长受阻。这可能是这些对氧敏感的蛋白的功能发生了变化，从而引起代谢途径发生了变化。然而，这些对氧化物敏感蛋白酶很难鉴定，而且受到影响的代谢途径也不一样。例如大肠杆菌突变体只有在提供所有氨基酸的基本培养基上才能生长，这可能因为：1.脱水酶失活，支链氨基酸合成爱阻[CF Kuo et al., 1987]；2.由于转羟乙醛酶失活，导致芳香族类生物合成受阻[L Benov and I Fridovich, 1999]；3.由于膜损伤导致亚硫酸盐流失[L Benov et al., 1996]。同样的现象亦存在于其它SOD缺失的微生物中。然而，有时即使在基本培养基上添加所有必需氨基酸，SOD突变体亦不能生长，提示有其它的代谢途径受损[JA Imlay and S Linn, 1986]。

胞质SOD突变造成膜损伤。试验表明，在有氧条件下，SOD突变体的膜系统受到损伤[JA Imlay and I Fridovich, 1992]，一般认为这是因为膜上的有饱和脂类发生了过氧化作用。但膜的损伤很难定性，也很难研究。因为在微生物的膜上极少有不饱和脂类存在，因此膜损伤不可能只是由于脂质过氧化作用。

2.5.4细菌SOD突变体的应用

研究发现，外源SOD基因在sodA、sodB同时突变的大肠杆菌中表达，可以通过功能互补使突变体恢复在含paraquat平板上或基本培养基上生长的能力。因此，该突变体被广泛应用于其它SOD基因的克隆，这对于没有完成基因组测序的物种尤其有用[K Keyer et al., 1995; MJ Pianzzola et al., 1996]。

目前还不能对由于SOD突变给机体所造成的损伤进行全面研究，因为这些伤害可能来自于一些功能蛋白对氧自由基敏感，也可能是在特殊情况下敏感性增加。因此，S. meliloti sodA突变体固氮能力下降就有可能是因为固氮酶系的失活，但结瘤能力下降的原因仍不太明了[JA Imlay and S Linn, 1986]。在多数胞质SOD突变中，其毒力下降则可能是因为与寄主互作时代谢活动旺盛，从而导致内源氧自由基上升，而胞外周质中SOD突变而导致的毒力下降则可能与其拮抗寄主氧迸发能力下降有关[M Lynch and H Kuramitsu, 2000]。

虽然目前我们对SOD突变所造成影响的认识还远远不够，但随着越来越多微生物SOD突变体的构建，我们将会进一步认识SOD新的功能，鉴定出新的对氧自由基敏感的蛋白酶，并可能发现新的氧自由基来源，进而更深层次理解氧自由基直接或间接的毒害作用的机理。

    研究发现，微生物的CuZn-SOD和Fe-SOD多为组成型表达，而Mn-SOD多为诱导型表达。如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和大肠杆菌中Fe-SOD在整个生育期都有低水平的表达，但在胁迫情况下，Mn-SOD会被诱导并大量表达。因此，本节主要以大肠杆菌中Mn-SOD为例来阐述SOD的表达调控。

大肠杆菌中，环境因子对Fe-SOD水平影响不大，一般认为，它是防御氧自由基的第一道防线。Mn-SOD在无氧条件下通常不表达，在有氧环境下被诱导表达，尤其在提高氧含量即在氧协迫情况下，Mn-SOD会超量表达。由此认为，Mn-SOD可能在防御氧自由基损伤中起重要作用，它能决定氧协迫时SOD活性的高低。

2.6.1 soxRS对Mn-SOD表达的调控

研究发现，当超氧化物含量增加时，大约有40种蛋白的合成量显著提高，基中15种蛋白受soxRS基因座(superoxide response locus)的控制[Walkup LKB and T Kogoma 1989; Greenberg JT and B Demple, 1989; Stefan I liochev et al., 1999]。依赖soxRS诱导的基因产物有Mn-SOD、DNA修复酶系中的内切核酸酶Ⅳ、葡糖-6-磷酸脱氢酶、NADHP-Paraquat黄递酶、修饰后的核糖体蛋白、soi基因的产物和某种重要的孔蛋白基因的反义抑制因子等。有趣的是，其中葡糖-6-磷酸脱氢酶的产物NADPH可被NADPH-Paraquat黄递酶利用并促进甲基紫精产生超氧化物，而SOD在此过程中发挥重要的调节作用。因此，微生物体内的调节结果是维持一种超氧化物产生与消解之间的平衡。

通过检测β-半乳糖苷酸的表达量，发现与之融合的Mn-SOD在有氧环境下的Sox缺失的菌株中有低水平表达，但不能被甲基紫精诱导；在Sox组成型表达的菌株内，Mn-SOD能高水平的表达，但不能或仅仅轻微的能够被甲基紫精诱导。在无氧条件下，Sox突变对融合蛋白的表达量没有影响，但Sox突变的菌株体内的内切核酸酶IV会过量表达，这时sodA的表达受到抑制，说明在无氧条件下，有其它因子通过SoxR-SoxS途径来调控sodA的活性。在内切核酸酶IV基因序列的-90和-110区发现有回文结构，推测可能为Sox结合位点[Cunningham and Saporito,1990]。

2.6.2 Fur蛋白对Mn-SOD表达的调控

随着地球上氧的出现，铁变得几乎不溶，微生物不得不进化出一种能消化铁的代谢系统。在大肠杆菌中，大约有30种基因与铁的吸收有关[Braun,1985]。这些基因受Fur(Ferric uptake regulation)基因产物的调节[Hantke,1982;1984; Sarah Dubrac and D Touita, 2000]。当铁元素丰富时，Fur蛋白被活化，这种活化的Fur蛋白结合到一处称为铁盒子的基因序列上而成为这些基因转录的抑制因子。在体外，Fur蛋白可利用多种二价金属离子作为其辅助因子，但在活体内则倾向于与二价铁离子结合[EC Niederhoffer et al., 1990]。

在sodA序列中，含有两个启动子区，在正常生长状况下，只有一个发挥作用[Takeda and Avila,1986]。sodA启动子区包含两个重叠的Fur保守序列，它与-35区RNA聚合酶结合位点重叠，该区即为通常认为的铁盒子序列。通过蛋白纯化和电泳条带移位分析发现，二价锰离子和Fur的复合体能与sodA的DNA结合。铁螯合剂使Fur失活，所以可以通过加入铁螯合剂来模拟Fur突变的生理生化变化，但铁螯合剂可能还在翻译后水平对菌的代谢产生影响。

2.6.3 arcAB对Mn-SOD表达的调控

在缺氧条件下，作为传感蛋白，ArcB能感知某种不适的呼吸状态并激活作为调节蛋白的ArcA。ArcA可以作为激活因子调控一些在需氧呼吸过程中起作用基因的表达，如琥珀酸脱氢酶、乳糖脱氢酶和顺乌头酸酶等[Iuchi et al., 1989]。这些酶均可形成某种二元体系。在缺氧条件下，ArcA和ArcB基因双突变体内sodA能正常表达。研究发现，该双突变体内1个突变发生在fur通路，另一个突变么在ArcA基因上，要么在ArcB基因上。Arc基因突变对fur野生菌菌体内的sodA-lacZ的表达没有影响。然而，当加入螯合剂或是fur突变后。Arc突变体sodA表达正常，说明Fur或Arc在发挥抑制作用时是相互独立的。在有氧条件下，Arc突变不对有氧呼吸产生影响，表明ArcA对有氧呼吸不发挥作用[Iuchi, 1988]。

目前还没有找到ArcB的识别信号。不过，ArcA的产物是一种可溶性蛋白，ArcB可能锚定于靠近内表面的膜上，那是它发挥作用的位点。ArcB含有一半胱氨酸残基，它可能与该蛋白能感知氧化还原状态有关。ArcB能感知终端电子传递链产生的还原型的氧的浓度，或感知一种在氧化还原反应过程中存在的一种非自氧化成分。如其它二元系统一样，ArcB被认为能通过磷酸化作用接受和转导信号[Iuchi et al, 1990]。

2.6.4 DNA的构像及整合宿主因子(IHFs)对Mn-SOD表达的影响

DNA的拓扑结构在sodA表达中起重要作用，DNA超螺旋的改变会产生一系列生理生化效应。多种环境因子都可以通过改变DNA的起螺旋状态来调节许多种启动子的转录。如DNA回旋酶和DNA拓扑异构酶I会首先对DNA的螺旋状态作出反应。早期的研究认为与有氧调节有关的oxrC基因现被认为能够影响DNA的负超螺旋程度[Ni Bhriain et al., 1989]。研究发现，在体外以超螺旋质粒DNA为模板的转录水平只有以线性DNA为模板的转录水平的1/10~1/5。另外，回旋酶抑制因子、萘啶酮酸和香豆霉素A均能刺激MnSOD的表达。

在Mn-SOD基因序列中有几处可能是整合宿主因子(integration host factors, IHFs)结合位点。这些位点一般位于-35区RNA聚合酶结合位点，或位于其附近的回文结构上。整合宿主因子是与特殊的DNA序列作用的DNA结合蛋白，它优先与DNA螺旋中DNA骨架结合并诱导其形成一大于140o的回折，从而发挥调控作用[Takeda and Avila,1986]。

有1个保守的IHFs的序列位于sodA的调节区，它与铁盒子重合。因此，IHFs的结合可能会影响到Fur结合。通过定向突变技术改变整合宿主因子的作用位点后发现，在多拷贝质粒上的Mn-SOD得到组成型表达，而且这种表达不再受培养基中铁螯合剂的影响，亦不受培养基中Paraquat的影响，说明DNA的改变可能会改变了sox在DNA上的结合位点，或是改变了DNA的拓扑结构，从而消除了sox对Mn-SOD的激活作用。

渗透协迫和有氧与无氧环境的互换均可改变DNA的超螺旋状态。目前还不清楚导致DNA拓扑改变的信号是什么，推测这些信号可能来自于细胞膜，那么DNA拓扑变化对Mn-SOD的调节就可能与膜损伤有关。代谢活动上升需要更多SOD，这种由整全宿主因子感知的信号可能是生长速率的变化，但在体内，生长速率增长4倍时整合宿主因子α亚单位增长15倍，暗示两者之间可能是一种级联反应的关系，这种组联反应使菌体能够更加迅速适应生长状态或是环境因子的变化。

2.6.5 Mn-SOD活性的翻译后水平调控

将sodA的启动子用lac启动子替换，然后构建到多拷贝质粒上，发现Mn-SOD的表达量依赖于培养基中的Mn离子的含量。在培养基中加入100μmol/L Mn离子并加入paraquat后发现，Mn-SOD表达量剧增，说明当脱辅基蛋白大量合成时，培养基中的Mn离子太少，以致于不能占有全部活性位点，从而导致有部分Mn-SOD脱辅基蛋白无法正常表现出应有的Mn-SOD的活性[D Touati, 1988; Compan Ines and Dnaiele Touati, 1993]]。

无氧呼吸情况下机体可以产生没有活性的Mn-SOD。重建试验表明，这些SOD缺乏活性是因为酶的活性位点被其它金属离子抢占，这种金属离子可能是铁离子，因为它在有氧条件下会与Mn竟争SOD的活性位点[Beyer and Fridovich I, 1991]。翻译后水平调节还表现为缺氧条件下，当加入铁螯合剂二氮杂菲后，Mn-SOD活性会有所升高。

缺氧时，Mn-SOD表达受到抑制，因这时不存在氧协迫。氧或是细胞内的氧化状态可诱发产生一种由ArcB传递给ArcA的初级信号，当氧协迫加剧时，Arc抑制作用解除，sox被激活并随氧协迫程度而改变。厌氧条件下，Arc阻遏Mn-SOD表达，正如Arc阻遏其它与需氧生理活动一样，这是一种最经济的策略，即当需要时，ArcA即可抑制与需氧有关的生理活动。

铁Fur对Mn-SOD的调控在有氧及无氧环境中均可发生，是一种更微妙的调控机制。铁充足有利于羟自由基的形成，Fur不但在转录水平抑制Mn-SOD转录，还促使Fe取代Mn，从而导致Mn-SOD活性降低；氧化状态或是铁缺乏时，Fe-SOD失活，这时Mn-SOD活性快速上升。由于在无氧环境中，Arc就足以阻遏Mn-SOD的表达，所以Fur的主要作用可能是感知细胞中的铁含量或是感知细胞的氧化还原状态，尽管三价铁与二价铁之间的平衡与铁含量及细胞内的氧化状况均有关。

在大肠杆菌中，与Mn-SOD表达的调控有关的调节系统有两个明显的特点。第一是Mn-SOD的调控因子均为全局性细胞调控因子，这些调控因子除对Mn-SOD的表达进行调节外，还对机体中许多代谢途径产生影响，从而对细胞的代谢活动进行全方位的调节；第二是SOD缺乏会对细胞的生理活动产生影响，这有可能是Mn-SOD活性高低影响到细胞内超氧阴离子与羟自由基之间的平衡，从而诱发细胞产生相应的代谢变化。Mn-SOD诱导方式的多样化亦使其它与SOD有关的生理活动受到影响，这些生理活动都受铁缺乏、氧协迫、过量的超氧化物、膜相的改变以及代谢的变化等信号的诱导。

2.7 SOD基因表达调控的分子机理

B. subtilus的SOD基因编码区上游14-8bp存在SD序列，该序列上的6个启动子分别由σa,σb,σc,σd,σe,σf识别，同时在该基因附近有3个二级结构，一个位于sodA的下游，可能是转录终止子，而IR1和IR2在sodA编码区的上游，是sodA转录或翻译调控的结合位点[Takashi et al., 1998]。

小鼠CuZn-SOD mRNA的 5′非编码区结合有65kD的SOD-RBP(SOD RNA-binding protein，RNA结合蛋白)，该蛋白是mRNA翻译的抑制子[Gu et al., 1996]。Seo发现SP1和C/EBP家族(C/EBPalpha和C/EBP beta)调节人的CuZn-SOD的转录，SP1结合在CuZn-SOD的上游区域，激活与CuZn SOD相连的CAT的表达，扩大SOD基因表达的生物细胞范围，

图2.6 全局性细胞调节因子对SOD表达的调控

Fig.2.6 Hypothetical regulation of sodA transcription by the global regulators.

The 5′nucleotide sequence of E. coli sodA is shown.The two possible iron boxes are indicated. One IHF consensus sequence is underlined. Question marks indicate that effector DNA targets are not known. Hypothetical stimuli are imdicated.

而C/EBPα和C/EBPβ则可激活SOD的表达[Seo et al., 1997]。Nichols还对 Borrelia burgdorferi中SOD基因的转录情况进行了分析，发现secA与SOD构成一个37kb的转录单位，转录起始点在secA的起始密码子ATG上游100bp处[Nichols, 2000]。

2.8 SOD维持氧自由基平衡中的作用

在SOD突变的菌株内，由于全局性调控因子如Fur、soxRS等无法实现对突变体中Mn-SOD含量的调控，所以导致超氧阴离子自由基会大量积累。这时菌体的代谢途径受到明显的影响，不能在基本培养基上生长、突变概率增加等，说明SOD对于细菌正常的生理代谢是必不可少的。

然而，研究发现在真核生物的细胞中，SOD活性稍有升高，即产生毒害作用。如果通过多拷贝质粒产生过量SOD，也会对大肠杆菌产生毒害作用，说明在这种极端情况下，生物体内的自然平衡遭到破坏。事实上，与防御氧协迫有关的生化反应是彼此协调的，超氧化物水平增高会诱发许多蛋白酶的表达。另外，由于SOD活性提高导致过氧化氢浓度提高，过氧化氢的升高又会诱导另一套酶蛋白的表达。SOD过量还会导致过氧化氢和氧化性金属离子的积累，并最终增加了羟自由基的含量。羟自由基是目前已知氧自由基中活性最高的一种，它可以通过Fenton反应直接对DNA，蛋白质膜系统造成损伤。

在正常条件下，由于SOD受到多种全局性调控因子的调节作用，其含量亦维持一种平衡，一旦这种平衡被打破，就会导致氧自由基之间数量的消长，从而对机体产生极基复杂的影响，轻则影响代谢，重则导致机体死亡。因此，SOD水平高低对于保证机体正常的生理活动和生长发育具有十分重要的作用，这种作用主要是在氧自由基的种类与数量之间维持一种动态的平衡。

图2.7 SOD在氧自由基的产生与消除中的核心作用

Fig.2.7 Schematic representation of the role of SOD in maintaining the balance between the formation and abolishment of the oxygen free radicals.

2.9 SOD基因的克隆及表达

随着分子生物学的发展，SOD基因已经从多种微生物、动物、植物等生物中得到克隆并有部分在大肠杆菌、酵母、病毒、昆虫、哺乳动物中等得到表达。在大肠杆菌中，外源基因SOD基因的表达量在菌体可溶性蛋白中占相当高的比例[Chamber et al., 1992; Duan et al., 2000; 施惠娟等, 1999; 2000]，表达产物稳定性好，而且表达产物大多具有生物学活性[Brehm et al.，1991; Paramchuk et al., 1997; Dring and Richard, 1991; 施惠娟等, 1999; 2000]，还有一些表达产物表达出对极端条件有很高的耐受能力[Yamano et al., 1999]。

将酿酒酵母的CuZn-SOD基因克隆到酵母质粒载体pHZ-8，转化酵母菌，表达的蛋白占可溶性蛋白的15%，并且具有生物学活性[张博润, 1995]。将人CuZn-SOD结构基因克隆到含3-甘油醛磷酸盐脱氢酶基因启动子的酵母表达菌中，重组质粒产生CuZn-SOD约占细胞总蛋白的6%，且表达的SOD具有酶活性[Yoo et al., 1999]。由于酵母表达系统能够对外源基因表达产物进行类似高等生物细胞所进行翻译后加工和修饰，所以在酵母表达系统中对外源SOD基因进行表达为SOD的产业化提供了可能。另外，利用病毒作载体将SOD基因导入兔肺部，通过注射磷酸脂使其进入心脏及其他器官，显示出对心肌梗塞有很好的治疗效果[Li et al., 1998]。借助于不同表达体系来对SOD基因产物进行研究，为SOD的最终产业化奠定了坚实的基础。

2.11本项研究的立论依据

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是生物体防御氧化损伤的一种十分重要的金属酶。SOD广泛存在于生物体内，由于它能专一的清除生物体内的超氧阴离子自由基，抵御氧自由基和其他氧化物自由基对细胞质膜、蛋白酶及其它生物大分子和细胞器的损害，并能消除外源氧自由基对机体的损伤，故在维持机体氧自由基平衡方面起重要作用。

国内的SOD制剂大部分是从动物血液中提取，由于原材料有限，提取纯化困难等原因，导致SOD制剂纯度低、产量不高，市场供应存在较大缺口。而且，随着动物性传染病如疯牛病、口啼疫乃至严重急性呼吸系统综合症(severe acute respiratory syndrome, SARS)等恶性传染病在世界各地的不时报道，动物源血液制品的风险加大，为此对动物源血液制品的纯度提出了更高的要求，严格的质量控制又进一步增加产品成本。在此形势下，非动物源的、不存在风险或风险相对较小的SOD同类制品的研制与开发必将会得到加强。

本研究室进行SOD研究是由研究增产菌的的增产机理开始的，最初属于自选课题，后来曾纳入国家科技攻关计划，于1993年申报专利，专利号为ZL93103774.3，专利的核心内容是生产超氧化物歧化酶（SOD）的菌株及其生产工艺。该项技术不仅可以提纯不同纯度的SOD酶，还可用于医药，兽药，日用化妆品，保健饮料等。蜡质芽胞杆菌M22菌株(B.cereus M22)是本实验室从植物体内分离获得的有益内生细菌，具有促进植物生长、改善农产品品质、防治多种植物病害的效果[梅汝鸿，1991]。研究发现M22菌株代谢液和细胞内含有较高的SOD，能在作物细胞间隙并透过作物细胞膜催化O2-发生歧化反应，各种逆境下能减少氧自由基的伤害，表现出较强的抗逆性，从而在病害防治中起重要作用[夏立秋等, 1992]。研究蜡质芽胞杆菌M22的Fe-SOD时发现，它具有稳定性好，半衰期长，在较广泛的pH值(3~10)下均保存高的酶活等特点，但当时在多次试验中均未分离出Mn-SOD和CuZn-SOD，亦未涉及SOD分子生物学方面的研究[苏宁等, 1998; 1999]。

SOD是生物体内不可缺少的保护酶，是维持生物体微生态平衡的关键酶。目前，SOD的应用领域大致有以下几个方面：(1)SOD的临床应用;(2)SOD在日用化工方面的应用;(3)SOD作为保健食品添加剂;(4)农作物抵抗逆境方面。随着SOD在各个领域广泛成功的应用，对SOD的需求量日益增大。从70年代开始，牛血一直是生产SOD的主要原料，但由于牛血来源有限，特别是近年来如疯牛病等血液疾病的流行，从血液中获取的SOD逐渐受到人们的怀疑。一些学者逐渐转向利用植物生产SOD，但一般植物中SOD含量低，原料不便工业化生产且处理麻烦，至今尚未形成生产规模。国际上一些学者在研究利用动物血和植物生产SOD的同时，也致力于研究利用微生物生产SOD，与前者相比，微生物显示出其优越性，我们可以通过微生物发酵进行批量、连续地生产SOD，原料充足，成本也较低，还可以简化提取工艺。

随着现代分子生物学的发展，DNA重组技术在生命科学的各领域得到广泛应用。在原核生物体内通常含有两种SOD，即Fe-SOD和Mn-SOD，一般认为Fe-SOD是组成型表达，Mn-SOD为诱导型表达，通常在有氧情况下Mn-SOD含量大于Fe-SOD。但据本研究室毕业研究生苏宁等当时的研究表明，蜡质芽孢杆菌M22菌株中以Fe-SOD含量最高，这其中应该有与其它微生物不同的调控机制。这种不同在生态学上表现该菌株具有较强的内生作用，能够赋予宿主抗病、促生的功能，生理上表现为SOD表达量之间的比例与其它原核生物不同。开展分子遗传学的目的是克隆蜡质芽胞杆菌M22菌株(B.cereus M22)中所有可能的SOD基因，实现在原核及真核生物表达系统中的表达。

上述研究不仅有利于深入研究该基因的结构和转录调控的机理，有助于理解SOD在内生菌寄生和防病促生中的作用，也为生物遗传改良和基因最终的产业化提供基因资源。将DNA重组技术应用于SOD的工业化生产，既可以提高SOD酶的产量和纯度，降低成本，也可以克服动物来源SOD可能出现的不良后果。随着研究的不断深入，用高产SOD的菌株制备SOD制剂用到果树、蔬菜和大田作物上可以提高农产品中SOD的含量，生产SOD天然功能食品，对于提高农产品的附加值、增加农民收入和调整产业结构具有重要意义。